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FONDAZIONE iMe ISTITUTO MEDITERRANEO DI EMATOLOGIA

IL LIBT


Il Laboratorio di Immunogenetica e Biologia dei Trapianti (LIBT) della Fondazione IME, diretto dal Dott. Marco Andreani, rappresenta una delle realtà più attive in Europa per quanto riguarda la tipizzazione HLA, con circa 14000 test ogni anno su un totale di quasi 3000 campioni biologici ricevuti.

Oltre 600 pazienti affetti da diverse malattie ematologiche si sono rivolti al LIBT nel 2014 per identificare un possibile donatore HLA compatibile di cellule staminali emopoietiche.

I campioni biologici su cui il LIBT esegue i diversi test provengono dal centro trapianti della Fondazione IME, dall'Ospedale Pediatrico Bambino Gesù (OPBG), dal Roma Transplant Network (RTN), che include il Policlinico di Tor Vergata, e da centri in Paesi partner (come la Nigeria o i Paesi del Medio Oriente).

Il LIBT contribuisce inoltre alla diagnosi di malattie come la celiachia, la psoriasi, la misatenia, la narcolessia etc. determinando i particolari assetti genetici del sistema HLA ad esse associate (circa 400 pazienti nel solo 2014).

Ubicato al piano I° settore F (stanze 58 e 59) del Policlinico Tor Vergata di Roma, il LIBT si occupa della tipizzazione HLA (Human Leukocyte Antigen) di classe I e II utilizzando tecniche di biologia molecolare in bassa ed alta risoluzione e del monitoraggio dell'attecchimento dopo trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE).

Le indagini disponibili riguardano :
- Tipizzazione HLA dei pazienti affetti da patologie ematologiche maligne o genetiche proposti al trapianto di CSE, dei loro familiari e di potenziali donatori volontari non correlati.
- Tipizzazione HLA per determinare la predisposizione genetica in patologie HLA associate
- Monitoraggio dell'attecchimento delle cellule del donatore dopo trapianto di CSE


Elenco delle prestazioni fruibili
Elenco patologie HLA-associate

Personale LIBT
Dott. Marco Andreani - Direttore email: m.andreani@fondazioneime.org [curriculum]  [pubblicazioni]
Dott.ssa Manuela Testi - Responsabile servizio tipizzazione HLA email: m.testi@fondazioneime.org [curriculum]  [pubblicazioni]
Dott.ssa Maria Troiano - Biologa email: m.troiano@fondazioneime.org
Dott.ssa Mariarosa Battarra - Biologa email: m.battarra@fondazioneime.org
Dott.ssa Tiziana Galluccio - Biologa email: t.galluccio@fondazioneime.org
Dott. Giuseppe Testa - Capo Tecnico di Laboratorio email: g.testa@fondazioneime.org
Dott.ssa Annalisa Guagnano - Tecnico di Laboratorio email: a.guagnano@fondazioneime.org
Dott.ssa Rossella Condello - Tecnico di Laboratorio email: r.condello@fondazioneime.org
Dott.ssa Chiara Stellitano - Tecnico di Laboratorio email: c.stellitano@fondazioneime.org
Dott. Andrea Di Luzio - Tecnico di Laboratorio email: a.diluzio@fondazioneime.org
Dott.ssa Eleonora Paladini - Tecnico di Laboratorio email: e.paladini@fondazioneime.org
Signora Martina Mangione - Segretaria Amministrativa email: m.mangione@fondazioneime.org

Le basi dell'HLA

Gli antigeni HLA sono proteine o marcatori che si trovano sulla superficie della maggior parte delle cellule del nostro organismo.

Il sistema immunitario utilizza questi marcatori per riconoscere quali cellule appartengano al proprio organismo e quali no. Infatti, le cellule che mostrano sulla superficie antigeni HLA diversi da quelli del proprio organismo (non-self) sono percepite come invasori dal nostro sistema immunitario, che pertanto le rigetta.

Importanza della tipizzazione HLA

- Trapianto di cellule staminali ematopoietiche (CSE).
- Trapianto di organi solidi
- Associazione con specifiche malattie
- Test di paternità
- Farmacogenetica

Nel nostro laboratorio la tipizzazione HLA (Human Leukocytes Antigen) viene eseguita per studiare la compatibilità tra pazienti e donatori nel trapianto di cellule staminali ematopoietiche (CSE) o per determinare l'associazione con specifiche malattie.

Trapianto di cellule staminali ematopoietiche (CSE)

Per quanto riguarda il trapianto di CSE, una completa compatibilità HLA tra donatore e ricevente è essenziale per un pieno successo del trapianto stesso. In tal modo si riducono i rischi delle complicanze post trapianto rappresentate dal rigetto o dalla malattia contro l'ospite (in inglese Graft versus Host Disease - GvHD).

Associazione con specifiche malattie

I geni HLA di classe I e II sono stati associati a più di 100 malattie. Un gene HLA è associato ad una malattia quando la sua frequenza (in una sua forma all'elica) è aumentata o diminuita in maniera significativa nei pazienti affetti, rispetto ad un gruppo di controllo ben definito.

Terminologia HLA

La terminologia degli alleli HLA deve essere conforme all'ultimo report del comitato W.H.O. sulla nomenclatura. Gli aggiornamenti si possono trovare sul sito www.efiweb.org cliccando su "HLA Nomenclature Reports" o su "IMGT/HLA database". Lo schema seguente riporta la struttura della nomenclatura con il significato dei singoli 'campi'.

METODICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE UTILIZZATE

Sequenze Specific Primers (SSP)

Il metodo SSP è una tecnica basata sulla PCR che impiega Sequence Specific Primers (SSP), cioè primers sequenza specifici, per la tipizzazione tissutale molecolare.

I kit sono costituiti da miscele diverse di primers, in cui ciascuna miscela contiene una o più coppie specifiche di primers, vale a dire i primers specifici per un allele e/o un gruppo allelico, oltre ad una coppia di primers di controllo per sequenze conservate del campione. La coppia di primers di controllo ha la funzione di controllo interno della PCR e quindi di verifica dell'efficienza delle amplificazioni.

Il metodo si basa sul principio che un primer perfettamente corrispondente potrà essere utilizzato con maggiore efficienza nella reazione di PCR rispetto ad un primer che presenta uno o più mismatch all'estremità 3'. La specificità della tipizzazione rientra nella fase di amplificazione e il processo di elaborazione dei risultati avviene dopo una elettroforesi su gel di agarosio.

L'assegnazione degli alleli consiste nel constatare se si è verificata o meno l'amplificazione, cioè nel visualizzare l'amplificazione. I frammenti amplificati saranno separati mediante elettroforesi su gel di agarosio in presenza di colorante specifico, esposti a luce ultravioletta e fotografati. Ciascuna coppia di primers identifica due siti polimorfici in cis.

Sequence Specific Oligonucleotides (SSO)

Il test applica la tecnologia Luminex al metodo di tipizzazione del DNA con SSO reverse. Innanzitutto il DNA bersaglio viene amplificato mediante PCR usando primers specifici. Il prodotto di PCR ottenuto viene biotilinato, il che ne consente la rilevazione usando streptavidina coniugata a R-ficoeritrina (SAPE). Il prodotto PCR viene denaturato e fatto reibridare a sonde DNA complementari coniugate a microsfere fluorescenti. Un analizzatore a flusso identifica l'intensità fluorescente della PE (ficoeritrina) su ciascuna microsfera. L'assegnazione della tipizzazione HLA si basa sul pattern della reazione confrontato con i pattern associati alle sequenze dei geni HLA pubblicate. Il sistema di tipizzazione del DNA Luminex SSO si avvale di sonde oligonucleotidiche sequenza-specifiche legate a microsfere, per l'identificazione di alleli HLA in campioni di DNA genomico amplificati mediante una reazione di ibridizzazione DNA-DNA controllata, seguita dall'analisi con l'analizzatore a flusso. La miscela di microsfere consiste in una serie di microsfere fluorescenti recanti sonde oligonucleotidiche con sequenza specifica per gli alleli HLA. Ciascuna miscela di microsfere comprende un controllo negativo e positivo costituiti da microsfere per la sottrazione dei segnali di fondo non specifici e la normalizzazione dei dati grezzi per compensare la possibile variazione nella quantità di campione e nell'efficienza della reazione.

Sequenze Based Typing (SBT)

Il sequenziamento del DNA è la determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi (Adenina, Citosina, Guanina e Timina) che costituiscono l'acido nucleico. All'interno di questa sequenza sono codificati i geni di ogni organismo vivente, nonché le istruzioni per esprimerli nel tempo e nello spazio (regolazione dell'espressione genica). Il sequenziamento (SBT) rappresenta il metodo più completo per la caratterizzazione dei polimorfismi della regione HLA. I kit del commercio utilizzati per SBT, si basano su due tecnologie, amplificazione tramite PCR e sequenziamento automatico diretto del DNA tramite fluorescenza. I geni di interesse vengono amplificati in una miscela di amplificazione utilizzando AmpliTaq Gold. L'amplificato risultante, trattato con ExoSAP-IT per rimuovere i primer non incorporati e i dNTP, verrà utilizzato come templato per il sequenziamento del DNA con BigDye Terminators. Le sequenze di DNA vengono in seguito rilevate tramite un sequenziatore automatico di DNA a fluorescenza e i dati vengono analizzati con un programma di tipizzazione degli alleli HLA.

Monitoraggio dell'attecchimento

I Microsatelliti (STRs) sono una forma elementare di DNA ripetitivo nucleare, costituiti da ripetizioni di due, tre, quattro o cinque paia di basi in raggruppamenti molto corti che non superano mai le 300bp. Gli STRs hanno sequenze stabili e frequenze geniche bilanciate che possono essere facilmente amplificate mediante PCR, tipizzate con tecniche elettroforetiche standard e confrontate con opportuni ladder allelici. Inoltre sono caratterizzati da una moderata variabilità, da un limitato numero di forme alleliche, da ridotte dimensioni molecolari e da un ristretto intervallo tra l'allele a peso molecolare più basso e quello a peso molecolare più alto. È possibile amplificare più di un sistema microsatellite contemporaneamente ottenendo dei risultati in tempi molto brevi. Non tutti i sistemi microsatelliti conosciuti sono adatti come "marcatori genetici", ma per essere utilizzati devono avere alcuni requisiti. Innanzitutto bisogna valutare il loro potere discriminativo (PD), ovvero la probabilità che due individui all'interno di una popolazione abbiano genotipi diversi. Questo valore è legato ad altri parametri come al numero di alleli (grado di polimorfismo) e alla loro distribuzione all'interno della popolazione (indice di eterozigosità). Un altro parametro importante da valutare è il tasso di mutazione che deve essere compreso tra 5 x 10-4 e 10-5. Affinché possa essere impiegato di routine come marcatore genetico, un sistema microsatellite viene analizzato in ogni suo aspetto e studiato approfonditamente facendo studi popolazionistici. In questo laboratorio per determinare il chimerismo nei trapianti allogenici di midollo osseo vengono utilizzati 9 diversi microsatelliti più il locus del sesso utilizzando un sistema multiplex. Un paziente sottoposto a trapianto allogenico di cellule staminali può essere definito una " chimera " in quanto le cellule generate dal midollo osseo del donatore hanno un corredo genetico diverso da quello del ricevente. Il paziente dopo il trapianto può presentarsi con uno stato di chimerismo completo, in cui tutte le cellule del midollo e del sangue periferico presentano il genotipo del donatore, di chimerismo misto, in cui si assiste ad una contemporanea presenza di cellule del donatore e del paziente o di assenza di cellule del donatore, ovvero di rigetto del trapianto.

ELENCO DELLE PRESTAZIONI FRUIBILI

Codice Tariffario Nazionale Prestazione
91.36.5 ESTRAZIONE DI DNA
90.78.2 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLA-A a bassa risoluzione
90.78.4 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLA-B a bassa risoluzione
90.79.1 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLA-C a bassa risoluzione
90.81.1 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLADRB1 a bassa risoluzione
90.80.3 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLA-DQB1 a bassa risoluzione
90.78.2 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLA-A ad alta risoluzione
90.78.4 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLA-B ad alta risoluzione
90.79.1 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLA-Cw ad alta risoluzione
90.81.2 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLADRB ad alta risoluzione (DRB1,-B3,-B4,-B5)
90.80.2 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLA-DQA1 ad alta risoluzione
90.80.4 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLA-DQB1 ad alta risoluzione
90.79.5 TIPIZZAZIONE GENOMICA HLA-DPB1 ad alta risoluzione
91.30.2 ANALISI POLIMORFISMI STR o VNTR con reazione a catena e analisi automatica di frammenti


ELENCO DELLE PRINCIPALI PATOLOGIE

Celiachia
Diabete Tipo I
Artrite Reumatoide
Artrite Giovanile
Spondilite Anchilosante
Artrite Reattiva
Uveite
Malattia di Behcet
Sclerosi Multipla
Miastenia Grave
Narcolessia
Psoriasi
Lupus Eritematoso sistematico
Sclerodermia


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